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PCR
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La PCR (Reazione a Catena della Polimerasi) è una tecnica fondamentale in biologia cellulare per amplificare in vitro grandi quantità di specifiche sequenze di DNA sfruttando il principio della replicazione. Il processo avviene tramite cicli termostatici su termociclatore che includono tre fasi: denaturazione a 94°C, appaiamento dei primer a 60°C ed estensione con Taq-polimerasi a 72°C, raddoppiando la quantità di prodotto in ogni ciclo fino a miliardi di copie.
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- La PCR è la tecnica di Reazione a Catena Polimerasi utilizzata per ottenere in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA complessa, ispirandosi al principio naturale della replicazione del DNA.
- Il processo richiede un DNA templato, due primer oligonucleotidici, dNTP e Taq polimerasi termostabile, ed avviene tramite cicli ripetuti di tre tappe: denaturazione a 94°C per separare le eliche, appaiamento dei primer a 60°C e estensione a 72°C.
- Attraverso questi cicli di denaturazione, rinaturazione e polimerizzazione, la sequenza viene amplificata esponenzialmente (fattore 2 ogni ciclo), raggiungendo miliardi di copie in circa 31 cicli.
- In particolare, questa tecnica è fondamentale per produrre copie del cDNA ottenuto da mRNA cellulari, utilizzando oligonucleotidi complementari all'inizio e alla fine della sequenza come innesci per la polimerizzazione.
- Le copie di cDNA generate possono essere direttamente inserite in vettori di clonaggio se gli innesci contengono sequenze di taglio per endonucleasi di restrizione, permettendo l'unione con il vettore tramite DNA ligasi.
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