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Prima Lezione - Metodologie per la produzione e caratterizzazione di biomolecole
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Clonaggio molecolare implica inserimento di DNA estraneo in batteri utilizzando vettori. Enzimi di restrizione tagliano DNA SORGENTE e VETTORE, creando estremità coesive per l'INSERTO. Batterio ospite accetta vettore con inserto, permettendo espressione proteica. Screening delle colonie si effettua tramite ibridazione con sponde radiofatiche. Vettori moderni ingegnerizzati presentano siti di restrizione concentrati e resistenza ad antibiotici per selezione batterica. Metodi di trasformazione include eletroporazione e CaCl2, permettendo DNA entrare nelle cellule batteriche.
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- Il clonaggio molecolare implica l'inserimento di DNA estraneo in batteri utilizzando vettori, che contengono siti di restrizione riconosciuti da enzimi di restrizione per unire inserto e vettore.
- Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in sequenze palindromiche, creando estremità coesive o sfalsate; la ligaasi chiude le lacune formate.
- Il screening delle colonie si effettua tramite ibridazione con sponde radiografiche per identificare solo le colonie contenenti il DNA di interesse, ma non più praticato in laboratorio.
- I vettori moderni contengono resistenza ad un antibiotico, DNA a doppia elica circolare e multipli siti di restrizione; sono utilizzati per trasformare batteri in colonie selezionate.
- La trasformazione delle cellule batteriche può avvenire attraverso l'elettroporazione o la trasformazione chimica con CaCl2, rendendo le cellule competenti a ricevere DNA esterno.
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