Riassunti VERIFICATO
Biochimica applicata Spettrofotometria
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Di cosa parla
- Spettrofotometria UV-Visibile:
- Coinvolge spettro UV (190-400 nm) e Visibile (400-750 nm) per transizioni elettroniche.
- Differisce dalla spettrofluorimetria: misura l'intensità della radiazione assorbita/emessa, non l'assorbimento di energia.
- I cromofori sono gruppi funzionali che assorbono luce, dando picchi specifici; tuttavia, la specificità può essere limitata.
- Vengono descritti gli effetti batocromico (aumento λ, diminuzione energia), ipsocromico (diminuzione λ, aumento energia), ipercromico (aumento assorbanza) e ipocromico (diminuzione assorbanza).
- La scelta del solvente è cruciale: deve sciogliere l'analita e non assorbire alla λ di analisi; molti solventi hanno una λ critica (cut-off) in UV.
- Strumentazione (Spettrofotometro):
- Comprende sorgente luminosa (UV: deuterio/xeno; Visibile: tungsteno/xeno), monocromatore (seleziona intervallo λ), cuvetta (quarzo per UV, vetro/plastica per visibile), fotomoltiplicatore (amplifica segnale) e registratore.
- Lo spettrofotometro diode array posiziona la cuvetta prima del monocromatore, utile per campioni incogniti.
- Legge di Lambert-Beer (A = Log(I₀/I) = k d C):
- Descrive la relazione tra assorbanza (A) e concentrazione (C) dell'analita, applicabile a soluzioni pure con cromofori non interferenti.
- Definisce trasmittanza (T) e i coefficienti di estinzione molare (ε) e percentuale (E%), utilizzati a seconda della conoscenza del peso molecolare dell'analita.
- Valori elevati di 'k' indicano maggiore capacità di assorbimento e sensibilità.
- Analisi Quantitativa e Curva di Calibrazione:
- Confronta la risposta del campione con soluzioni standard a concentrazione nota.
- Requisiti fondamentali: specificità, limite di determinazione e riproducibilità.
- La curva di calibrazione (concentrazione vs risposta strumentale) è usata per identificare il range di linearità, essenziale per analisi accurate.
- Applicazioni Specifiche:
- Denaturazione del DNA: La spettrofotometria studia la rottura dei legami idrogeno. L'aumento di temperatura causa un effetto ipercromico a 260 nm. La temperatura di melting (Tm) dipende dalla composizione G-C.
- Colorimetria per Proteine:
- Metodo di Lowry: Usa reattivo di Folin-Ciocalteu, lega anelli aromatici degli aminoacidi (660 nm). Sensibilità 10 mg/L, ma soggetto a interferenze (aminoacidi liberi), pH basico e instabilità del colore.
- Metodo del Biureto: Ione rame (Cu²⁺) forma complesso con legami peptidici (colore blu intenso). Più specifico (no interferenze aminoacidiche) ma meno sensibile (1 g/L), richiede pH basico.
- Metodo di Bradford: Blu Coomassie complessa aminoacidi basici (595 nm). Molto sensibile (50 mg/L), colore immediato e stabile, ma richiede pH acido.
- Colorimetria per Lipidi (Colesterolo e Trigliceridi): Entrambi i dosaggi sono indiretti e enzimatici, culminando nella formazione di chinoneimina (assorbimento a 500 nm). La specificità è garantita dagli enzimi utilizzati.
- Dosaggio Attività Enzimatica:
- Si misura la scomparsa del substrato, la formazione del prodotto o la conversione di un cofattore, se cromofori. Si opera con substrato in eccesso.
- Il profilo di reazione include lag phase, linear phase e substrate depletion. L'analisi solitamente avviene nella linear phase.
- Viene utilizzata una modificazione della Legge di Lambert-Beer per calcolare le Unità Enzimatiche (UE).
- Esempi di dosaggio: Uricasi (scomparsa acido urico), γ-GT (formazione para-nitroanilina), e indirettamente il glucosio tramite reazioni accoppiate con Esochinasi e Glucosio-6P deidrogenasi (misura conversione NADP+ in NADPH a 350 nm).
- Dry Chemistry:
- Metodica analitica che impiega reagenti fissati su strisce, senza solventi.
- Include striscette diagnostiche per metaboliti nel sangue (glicemia, colesterolo, trigliceridi) e wipe test per droghe in fluidi corporei.
- L'alcol test è un piccolo spettrofotometro che rileva l'etanolo nell'espirato tramite una reazione colorimetrica.
- Spettrofluorimetria:
- Si basa su eccitazione e emissione (λ maggiore rispetto all'assorbimento, effetto shift di Stokes).
- Utilizza fluorofori, molecole meno comuni dei cromofori, il che rende la tecnica più sensibile della spettrofotometria.
- La strumentazione è simile, ma con due monocromatori (eccitazione ed emissione).