Dispense VERIFICATO
SEQUENZIAMENTO
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Di cosa parla
- Macchinario di Replicazione del DNA:
- Illustra il processo di sintesi del DNA, mostrando l'allungamento di un filamento primer utilizzando un filamento stampo. L'incorporazione di un desossiribonucleoside trifosfato (dNTP) e il rilascio di pirofosfato formano legami fosfodiesterici.
- Sequenziamento del DNA - Metodo Enzimatico (Sanger):
- Si basa su una reazione di polimerasi che utilizza un oligonucleotide di innesco (primer).
- Il principio chiave è l'uso di didesossi-nucleotidi (ddNTPs), che possono essere incorporati nella catena nascente ma ne bloccano l'ulteriore allungamento.
- La differenza strutturale cruciale è l'assenza del gruppo ossidrile (-OH) in posizione 3' nel ddNTP, essenziale per la formazione del legame fosfodiesterico successivo, prevenendo così l'aggiunta di ulteriori nucleotidi.
- Sequenziamento Manuale (con Nucleotidi Radioattivi):
- Vengono allestite quattro reazioni separate, ognuna contenente dNTPs standard e un'esigua quantità di uno specifico ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), spesso marcato radioattivamente.
- Ogni reazione produce una serie di frammenti di DNA di diverse lunghezze, terminanti in corrispondenza di ogni occorrenza della base specifica (A, C, G o T) a seconda del ddNTP utilizzato.
- I frammenti di DNA vengono poi separati per dimensione tramite elettroforesi su gel, con i frammenti più piccoli che migrano più velocemente.
- La sequenza viene letta dal basso verso l'alto (dal frammento più piccolo al più grande) attraverso le quattro corsie del gel, identificando la base terminale di ciascun frammento per ricostruire la sequenza completa.
- Sequenziamento Automatico (con Terminatori 'BigDye'):
- È una reazione di PCR modificata che include una miscela dei quattro ddNTPs terminatori.
- I terminatori BigDye sono didesossi-nucleotidi che sono stati coniugati (marcati) con quattro diversi fluorocromi, ognuno emettendo una fluorescenza di colore differente per ciascuna delle basi (A, C, G, T).
- Durante la sintesi del DNA, l'incorporazione di un dNTP permette alla sintesi di procedere, mentre l'incorporazione di un ddNTP blocca l'allungamento della catena.
- Questo processo genera una miscela di frammenti di DNA di lunghezze diverse, ciascuno terminante con un ddNTP marcato fluorescentemente e con un colore specifico per la base terminale.
- Funzionamento del Sequenziatore Automatico:
- I frammenti vengono separati per lunghezza mediante elettroforesi capillare ad alta risoluzione, un processo più rapido e automatizzato rispetto al gel manuale.
- Un raggio laser eccita i fluorocromi sui frammenti man mano che passano attraverso un punto di rilevamento.
- Un rilevatore registra le emissioni di fluorescenza di diversi colori, che vengono poi trasmesse a un computer.
- Un software analizza i dati di fluorescenza, abbina ogni emissione luminosa al corrispondente ddNTP (e quindi alla base) e ricostruisce automaticamente la sequenza del DNA.
- Il risultato finale viene visualizzato come un elettroferogramma (o cromatogramma), che mostra una serie di picchi colorati, dove l'ordine e il colore di ogni picco corrispondono alla sequenza nucleotidica del DNA.