Appunti VERIFICATO
Estrazione, purificazione e quantificazione DNA genomico
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Di cosa parla
- L'isolamento e la purificazione del DNA genomico sono il primo passo in biologia molecolare, essenziali per separare e purificare gli acidi nucleici (DNA e RNA) da un campione biologico.
- Le fasi principali includono la preparazione del materiale biologico (colture cellulari, tessuti congelati), l'ottenimento dell'estratto cellulare tramite lisi, la purificazione del DNA da contaminanti e la sua concentrazione.
- Per la lisi cellulare, si utilizzano metodi specifici:
- Per le cellule batteriche: Lisozima (idrolizza peptidoglicano), EDTA (chela ioni Mg2+ stabilizzatori membrane e inattiva DNasi) e SDS (solubilizza lipidi e denatura proteine).
- Per le cellule animali/tessuti: Omogenizzazione meccanica (potter, ultrasuoni, congelamento/scongelamento) ed utilizzo di EDTA e detergenti blandi come SDS.
- La purificazione del DNA dall'estratto cellulare mira a eliminare le proteine e altri contaminanti:
- Enzimi proteolitici come Pronasi e Proteinasi K vengono usati per degradare le proteine contaminanti. La RNAsi elimina l'RNA.
- L'estrazione con fenolo-cloroformio-alcool isoamilico denatura le proteine (fenolo), rimuove i lipidi e facilita la separazione delle fasi (cloroformio), riducendo la schiuma (alcool isoamilico). La centrifugazione separa gli acidi nucleici (fase superiore acquosa) dalle proteine denaturate (interfase) e fenolo (fase inferiore).
- La concentrazione del DNA si ottiene precipitando gli acidi nucleici dalla fase acquosa superiore tramite l'aggiunta di etanolo assoluto (o isopropanolo) e cationi monovalenti, seguito da precipitazione a freddo e lavaggio del pellet con etanolo al 70%. Il DNA purificato viene risospeso in tampone TE.
- Per i tessuti vegetali, la purificazione è più complessa a causa degli alti livelli di carboidrati. Si impiega il CTAB (Cetil-Trimetil-Ammonio Bromuro), un detergente che forma un complesso insolubile con gli acidi nucleici. Dopo la dissociazione con NaCl, si procede con la precipitazione alcolica e trattamento con RNAsi.
- Metodi alternativi di purificazione includono:
- La cromatografia a scambio ionico, che separa le molecole in base alla carica, utilizzando resine anioniche per il DNA caricato negativamente.
- Il metodo del guanidinio tiocianato con particelle di silice, dove il guanidinio denatura le sostanze non nucleiche e il DNA si lega alla silice, per poi essere eluito.
- Le biglie magnetiche, che legano il DNA e vengono separate magneticamente, eliminando la necessità di centrifugazione.
- L'analisi quantitativa del DNA estratto viene effettuata tramite spettrofotometria, misurando l'assorbanza a 260 nm (A260) per determinare la concentrazione. Il rapporto A260/A280 valuta la purezza del DNA rispetto alle proteine (valori ottimali tra 1.8-2.0).
- L'elettroforesi su gel (Southern Blot) è usata per valutare l'integrità del DNA. Il DNA, caricato negativamente, migra verso il polo positivo attraverso un gel di agarosio. La velocità di migrazione dipende dalla dimensione e dalla concentrazione del gel, permettendo di verificare l'integrità del campione e la presenza di frammenti. Tamponi come il TAE (Tris-Acetato-EDTA) e coloranti come il Loading Buffer sono essenziali per il processo.