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Appunti genomica computazionale
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Il documento descrive la struttura del genoma umano e la variabilità genetica, cioè SNV, InDel e varianti strutturali, insieme al genoma di riferimento. Tratta poi le tecnologie microarray per SNP e CNV, con studi GWAS e progetti di popolazione, e il sequenziamento NGS, dall'allineamento al variant calling. Chiude con il sequenziamento a nanopori di terza generazione, il basecalling, il phasing e le possibili applicazioni cliniche.
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- Il genoma umano è diploide, con 22 coppie autosomiche e una coppia sessuale, e contiene circa 20mila geni la cui struttura di esoni e introni, insieme allo splicing alternativo, genera molte isoforme; le varianti sono classificate per dimensione (SNV, InDel, varianti strutturali) e per zigosità, e il loro effetto dipende da genotipo e aplotipo.
- Il genoma di riferimento, costruito dal Progetto Genoma Umano e poi gestito dal GRC fino alle versioni GRCh38/hg38 e T2T, è il sistema di coordinate rispetto a cui si descrivono tutte le varianti, mentre il formato del file di riferimento è un testo ASCII con sequenze per cromosoma.
- I microarray, a due colori (Agilent) o a un colore (Affymetrix), misurano l'ibridazione tramite sonde e la fluorescenza; l'analisi comprende addressing, segmentazione, correzione del background, normalizzazione (grafici MA, lowess) e metodi PM-MM, e permette di rilevare SNP e CNV tramite log2 ratio, segmentazione e stima dei mosaici.
- Gli studi GWAS confrontano casi e controlli con test del chi quadro, regressione logistica o lineare e producono Manhattan plot; presentano limiti legati alla replicabilità, alla rarità dei fenotipi e alla difficoltà di studiare le CNV, mentre i progetti HapMap, 1000 Genomes, SardiNIA, deCODE, Genomics England e TCGA/ICGC hanno ampliato la conoscenza della variabilità genetica.
- Il sequenziamento NGS produce short reads di circa 150 basi con paired end, memorizzate in file FASTQ, e si usa soprattutto per il resequencing con WGS, WES e pannelli target; i reads vengono allineati al riferimento producendo file SAM con campi e CIGAR, da cui si chiamano SNV e InDel con approcci frequentisti o bayesiani (GATK, VarScan) e si identificano le varianti strutturali con read-pair, split-read e read count.
- Il sequenziamento a nanopori, di terza generazione, legge il DNA nativo tramite variazioni di corrente ionica, consente long reads, rilevamento diretto delle citosine metilate, sequenziamento in tempo reale e adaptive sampling, ma ha un error rate più alto, richiede più DNA di partenza e necessita di basecalling con modelli a stati nascosti e reti neurali, incluso il modello flip-flop per gli omopolimeri.
- Per le long reads si usano allineamento con seeding, chaining ed extending, variant calling basato su signature e clustering, riallineamento locale e phasing per distinguere varianti in cis e in trans; l'uso clinico è limitato dagli errori, ma la tecnologia è utile per le varianti strutturali, le sequenze ripetitive e gli pseudogeni.
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