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Ingegneria genetica
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Isolamento e purificazione DNA: centrifugazione, lisi cellulare con lisozyma, EDTA e SDS, rimozione proteine con pronasi o RNAasi A, estrazione fenolo-cloroformio. Isolamento commerciale tramite cromatografia ionica o microsfere magnetiche. Purificazione da tessuti vegetali utilizzando CTAB. Valutazione DNA: spettrofotometria e gel elettroforesi. Estrazione RNA totale con agenti caotropici, Trizol o kit miRNeasy Mini. Analisi RNA: assorbanza allo spettrofotometro e gel elettroforesi.
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- Isolamento e purificazione del DNA: inizialmente si estrae il DNA da colture cellulari o tessuti, successivamente si rimuovono le proteine con enzimi proteolitici e RNAasi A, poi si utilizzano soluzioni di fenolo:cloroformio per separare il DNA dalla fase acquea. La concentrazione del DNA viene ottenuta aggiungendo sodio acetato e etanolo, successivamente si rimuovono i sali con lavaggi in etanolo 70%.
- Isolamento con kit commerciali: utilizzando metodi come la cromatografia a scambio ionico o microsfere magnetiche rivestite da silice, il DNA viene estratto e purificato con maggiore facilità e riproducibilità. Questi metodi sono più semplici ma richiedono attenzioni specifiche per evitare contaminazioni.
- Estrazione dell’RNA totale: l’RNA è estremamente labile, quindi si utilizzano agenti caotropici come guanidinio tiocianato o ioduro di sodio 4M per inibire le ribonucleasi e lisare il tessuto. Metodi come Trizol permettono la separazione dell’RNA dalla fase acquea attraverso l’aggiunta di cloroformio. Per l’isolamento, si utilizzano kit commerciali come miRNeasy Mini per purificare l’RNA totale.
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