Appunti VERIFICATO
Tutorial di laboratorio
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Di cosa parla
- Dosaggio Proteine: Tecnica colorimetrica (acido bicinconinico - BCA) per quantificare le proteine coinvolte nella crescita tumorale. L'estratto proteico reagisce con ioni rameici per formare un complesso viola (assorbanza a 562 nm), permettendo la determinazione della concentrazione proteica (microgrammi a 2 mg/ml) tramite curva standard BSA. Utilizzato per elettroforesi e Western blot.
- Resistenza Trans Endoteliale (TEER): Misura la resistenza elettrica trans endoteliale per caratterizzare modelli in vitro della barriera emato-encefalica (BBB) in tempo reale. Si esegue su cellule endoteliali in un sistema transwell con due elettrodi, misurando la resistenza del monolayer al passaggio di corrente. Un TEER elevato indica un monolayer compatto, ideale per testare farmaci e nanoparticelle.
- Living Cells Imaging: Caratterizzazione di linee cellulari endoteliali immortalizzate per modelli in vitro di BBB tramite microscopia confocale. Le cellule, seminate in piastre nere, vengono colorate con falloidina (per actina, rossa) e DAPI (per nuclei). Uno strumento automatizzato consente l'imaging in vivo della struttura citoscheletrica e nucleare.
- SDS PAGE e Western Blot (WB): Tecniche per identificare e semi-quantificare proteine.
- SDS-PAGE: Elettroforesi denaturante che separa le proteine per dimensione (4-250 kDa) utilizzando SDS e beta-mercaptoetanolo su gel di acrilammide. Il campione è colorato con blu Coomassie.
- Western Blot: Dopo SDS-PAGE, le proteine sono trasferite su membrana. Si verifica il trasferimento con rosso Ponceau, quindi si procede all'immunodecorazione: blocking, lavaggio, incubazione con anticorpi primari e secondari coniugati con perossidasi di rafano per l'identificazione tramite chemiluminescenza. L'intensità delle bande fornisce una misura semi-quantitativa.