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Analisi genomiche
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Il Next Generation Sequencing (NGS) è una tecnologia high-throughput che sequenzia DNA e RNA in parallelo su numerosi campioni, superando i limiti del metodo Sanger. Include fasi come frammentazione, legame di adattatori e amplificazione (es. bridge amplification, emulsion PCR). Diverse strategie di sequenziamento, come Sequencing by Synthesis (Illumina) e Sequencing by Ligation (SOLID), consentono applicazioni in genomica, trascrittomica, epigenomica e studio delle metilazioni (Methyl-seq) e della cromatina (ChIP-seq). La Single Cell Biology sfrutta le NGS per analizzare l'eterogeneità cellulare, superando il paradosso di Simpson, con workflow che includono isolamento, lisi e amplificazione del materiale genetico. L'analisi della metilazione del DNA e della conformazione della cromatina (tecniche 3C) sono cruciali per comprendere la regolazione genica e le patologie.
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- NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)
- Tecniche di sequenziamento parallelo di DNA e RNA su larga scala, riducendo i costi rispetto al metodo Sanger (1975).
- Il workflow NGS include: frammentazione del DNA (fisica o enzimatica), riparazione delle estremità, legame con adattatori specifici per creare una libreria genomica.
- Amplificazione tramite: Emulsion PCR (frammenti in micelle droplet) o Solid-phase Bridge Amplification (Illumina) (frammenti legati ad adattatori su flowcell, creando milioni di cluster clonali).
- Strategie di sequenziamento:
- Sequencing by Ligation (SOLID): Utilizza ligasi, sonde di 8 pb con basi note/degenerate e fluorofori, con codifica a due basi. Alta accuratezza ma lunghezza di lettura limitata (85bp).
- Sequencing by Synthesis (Illumina): Libreria amplificata su flowcell, sequenziamento con primer terminatori reversibili fluorescenti; rilevazione, clivaggio, rigenerazione 3'OH. Genera 100-200 milioni di sequenze.
- Pirosequenziamento (Roche, dismesso 2015): Aggiunta di un nucleotide per volta, rilascio di pirofosfato e cascata enzimatica che produce luce.
- Ion Torrent (Thermofisher): Rileva ioni H+ rilasciati dall'incorporazione di nucleotidi tramite un semiconduttore.
- Le letture possono essere single-read (una direzione) o paired-end (entrambe le direzioni).
- Applicazioni: sequenziamento DNA genomico, whole-exome, targeted sequencing, deep sequencing (per varianti rare), RNA sequencing (trascrittomica, per espressione e isoforme), ChIP-Seq (studio interazioni DNA-proteine), Methyl-Seq (studio pattern di metilazione).
- SINGLE CELL BIOLOGY
- Studia le singole cellule per superare l'eterogeneità e il paradosso di Simpson nelle popolazioni.
- Identifica tipi cellulari rari, variazioni genomiche/trascrittomiche individuali.
- Il workflow comprende: ottenimento del campione, isolamento cellulare (diluizione, micromanipolazione, FACS, microfluidica, laser-capture microdissection, dissociazione tissutale), lisi, amplificazione (whole-genome o trascrittoma), analisi (NGS, RT-PCR) e interpretazione dati. Attenzione ai 'Batch effect'.
- DNA METHYLATION
- Metilazione della citosina in posizione 5 (isole CpG) da parte delle DNMTs. Ruolo in condensazione cromatina, silenziamento genico, imprinting, differenziamento.
- Pattern aberranti nel tumore (promotori ipermetilati, geni ipometilati).
- Metodi di rilevazione: HELP assay (enzimi di restrizione), MeDIP (immunoprecipitazione con anticorpi), Bisulfite Sequencing (conversione C non metilata in uracile, seguita da PCR e sequenziamento per creare 'epigrammi di metilazione').
- CHROMATINE ANALYSIS
- Studia l'organizzazione e le interazioni della cromatina.
- Metodi:
- DNase I Hypersensitivity: Identifica siti accessibili all'idrolisi (decondensati) tramite digestione enzimatica e sequenziamento.
- FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements): Cross-linking, sonicazione, estrazione fenolica per isolare DNA non complessato e identificare regioni meno compatte.
- ChIP (Chromatin Immunoprecipitation): Targettizza modifiche istoniche o fattori di trascrizione con anticorpi, seguita da immunoprecipitazione e analisi del DNA (PCR, sequenziamento).
- Chromosome Conformation Capture (3C techniques): Studia interazioni intercromosomiche fissando DNA con formaldeide, digerendo con enzimi di restrizione, ligando e amplificando. Include: 3C (one vs one), 4C (one vs all), 5C (many vs many), Hi-C (all vs all), e Capture-C.
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