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biotec ricombinanti appunti prof. Trovato
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Il processo delle biotecnologie ricombinanti inizia dall'isolamento del gene target, il suo inserimento in un vettore e l'introduzione nel ospite cellulare per la clonazione. Le tecniche fondamentali includono la purificazione degli acidi nucleici tramite rottura cellulare, rimozione proteica con enzimi o fenolo/cloroformio e precipitazione selettiva con alcol sfruttando le proprietà dielettriche. Per separare DNA da RNA si usano rispettivamente RNasi o DNasi, mentre il plasmidico viene distinto dal genomico grazie alla capacità di rinaturazione circolare dopo denaturazione alcalina.
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- L'isolamento del DNA richiede la rottura delle membrane cellulari mediante metodi fisici, enzimatici o chimici seguita dalla rimozione selettiva delle proteine tramite enzimi proteolitici come la Proteinasi K o solventi organici quali fenolo e cloroformio.
- La precipitazione degli acidi nucleici in soluzione alcolica sfrutta il principio che l'aggiunta di etanolo riduce la costante dielettrica del mezzo, permettendo ai cationi monovalenti di neutralizzare le cariche negative dello scheletro zucchero-fosfato e favorire l'aggregazione delle molecole.
- La separazione tra DNA genomico lineare e plasmidico circolare si ottiene sfruttando la capacità del plasmide superavvolto di rinaturarsi dopo denaturazione alcaline, oppure mediante centrifugazione in gradiente di densità su CsCl che sfrutta l'intercalazione differenziale del bromuro di etidio.
- I metodi alternativi per la purificazione includono la cromatografia a scambio ionico anionica basata sull'affinità delle molecole cariche negativamente e le tecniche su matrice di silice che sfruttano legami idrogeno in presenza di agenti chaotropici come l'isocianato di guanidinio.
- Nella purificazione del DNA vegetale, il metodo CTAB permette di precipitare selettivamente i polisaccaridi ad alte concentrazioni saline mentre gli acidi nucleici precipitano a basse concentrazioni, facilitando la rimozione delle impurità tipiche dei tessuti vegetali.
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