Domande d'esame VERIFICATO
BB
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Di cosa parla
- Trasporto Citosol Mitocondrio:
- I mitocondri hanno due membrane (esterna e interna), spazio intermembrana e matrice. L'import è post-traduzionale.
- Le proteine hanno sequenze segnale N-terminali anfilatiche e sono mantenute denaturate da Hsp70 (Pre-proteine).
- Sistemi di traslocazione: TOM (membrana esterna), SAM (proteine membrana esterna), TIM (membrana interna, con TIM22 per integrali e TIM23 per matrice), MIA (spazio intermembrana), PAM (chaperoni).
- L'entrata avviene in due fasi: riconoscimento/ancoraggio (dipende dal potenziale di membrana) e traslocazione (richiede energia ATP).
- Il destino proteico è determinato da sequenze segnale secondarie post-TOM.
- Sistema del Galattosio (System Biology):
- Il sistema GAL nel lievito sfrutta il galattosio con 9 geni (regulone): regolatori (GAL3, GAL6, GAL4 attivatore, GAL80 inibitore) e strutturali (GAL2/HTX trasportatori, GAL1 galattochinasi, GAL7/10 conversione gal-1-P, GAL5 conversione glu-1-P).
- Lo studio ha coinvolto perturbazioni genetiche e ambientali (galattosio+raffinosio vs. solo raffinosio).
- Metodi: espressione genica, trascrittomica (microarray) e proteomica (SILAC).
- Risultati hanno mostrato l'importanza di GAL1 per evitare tossicità da galattosio-1-P e il ruolo di GAL80 nella repressione.
- Secondi Messaggeri:
- Proprietà: basso MW, non proteico, solubile, amplificazione e rapida sintesi/degradazione.
- Esempio: cAMP, sintetizzato da ATP tramite adenilato ciclasi (stimolato da epinefrina, glucagone; inibito da adenosina).
- Il cAMP attiva la PKA (proteina chinasi A), composta da 2 subunità catalitiche e 2 regolatorie. Il legame del cAMP alle subunità regolatorie ne provoca il distacco e l'attivazione delle catalitiche.
- PKA fosforila la glicogeno sintasi (inattiva) e la fosforilasi chinasi (attiva), promuovendo la degradazione del glicogeno.
- Nel nucleo, PKA fosforila CREB che, legando CBP, attiva la trascrizione.
- Interazioni Proteina-Proteina (Via Ras-MAPK):
- I recettori tirosin chinasici (RTK) dimerizzano e si autofosforilano dopo il legame con fattori di crescita (es. EGF).
- Il complesso Grb2-Sos si lega ai Tyr fosforilati e porta Sos vicino a Ras. Sos è una GEF che attiva Ras (GDP→GTP).
- Ras-GTP avvia la cascata MAPK: Raf1 → MEK → MAPK (ERK). MAPK trasloca nel nucleo e fosforila fattori di trascrizione (Jun, Ets) per l'espressione di geni precoci e tardivi (es. E2F per cicline CdK).
- CycD1-CdK4 fosforila Rb, che rilascia E2F per la sintesi di cicline E/A, promuovendo l'entrata nel ciclo cellulare.
- Fosforilazione delle Proteine:
- Modifica la funzionalità proteica su Ser, Thr, Tyr (donatore NTP, rimozione per idrolisi).
- Le chinasi aggiungono P, le fosfatasi lo rimuovono.
- Classificazione delle chinasi: Ser/Thr, Tyr specifiche, o entrambi.
- Esempi: inattivazione di isocitrato deidrogenasi e glicogeno fosforilasi tramite fosforilazione.
- Tecniche di studio: band shift, western blot, spettrometria di massa.
- Ingegneria Proteica (Tecniche):
- Mutagenesi sito-diretta: modifica specifica di basi o codoni. Generazione di librerie di codoni randomizzati con oligonucleotidi degenerati.
- Error-prone PCR (epPCR): introduce mutazioni casuali tramite Taq polimerasi con bassa fedeltà, condizioni alterate di Mg2+/Mn2+, dNTP.
- DNA Shuffling: ricombinazione genetica di frammenti di DNA omologhi (da DNasi I) per creare varianti chimeriche.
- Phage Display: espressione di varianti proteiche come fusione con proteine del capside di un fago. Selezione per affinità di legame con un recettore immobilizzato. Identificazione delle varianti migliori tramite sequenziamento.
- Definizioni:
- Molten globule: stato compatto, con struttura secondaria ma non ancora completamente foldata.
- Pre-molten globule: meno compatto, con elementi di struttura secondaria ma ancora molta random coil.
- Random coil: stato disordinato e flessibile della proteina.
- Stop transfer sequence: sequenza idrofobica transmembrana che arresta la traslocazione e ancora la proteina nella membrana.
- Effettore omotropico positivo: ligando che si lega al sito catalitico di un enzima allosterico e ne aumenta l'attività.
- Arricchimento GO: quando specifici termini GO (Gene Ontology) sono sovra-rappresentati in una lista di geni differenzialmente espressi, indicando processi biologici attivi.
- Proteoma e 2D-DIGE: il proteoma è l'insieme delle proteine in una cellula in una data condizione. 2D-DIGE (elettroforesi bidimensionale) separa le proteine per pI e massa, permettendo di quantificare e identificare le differenze di espressione tra campioni marcati con coloranti fluorescenti (MALDI-TOF, spettrometria di massa in tandem).