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Tecniche di biologia molecolare
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Di cosa parla
- Identificazione ed Estrazione degli Acidi Nucleici: Vengono illustrate le fasi per l'estrazione di DNA genomico e RNA, che includono omogenizzazione (lisi), digestione con DNase/RNase, estrazione con solventi organici, precipitazione in etanolo e centrifugazione.
- Analisi del DNA:
- PCR (Polymerase Chain Reaction): Una tecnica per amplificare quantità molto piccole di DNA, utilizzata nella diagnosi di malattie genetiche, studio di mutazioni, sviluppo di tumori e infezioni virali/batteriche. Si elencano i componenti (DNA template, dNTP, Taq polimerasi, primer, Mg++, H2O) e il ciclo (denaturazione, annealing, allungamento).
- Southern Blot: Tecnica per rivelare specifiche sequenze di DNA, che comprende estrazione, purificazione, restrizione, corsa elettroforetica, trasferimento su membrana e ibridizzazione con sonda marcata.
- Analisi dell'mRNA:
- RT-PCR (Reverse Transcription PCR): Utilizzata per analizzare l'mRNA, trasformandolo in cDNA tramite trascrittasi inversa, seguito da amplificazione PCR. I componenti includono RNA template, trascrittasi inversa, dNTP, Taq polimerasi, primer (senso e antisenso) e Mg++.
- Northern Blot: Analogo al Southern Blot, ma specifico per la rilevazione di mRNA. Richiede precauzioni come la denaturazione dell'mRNA e la sterilizzazione degli strumenti.
- In Situ Hybridization: Metodica che usa sonde di mRNA marcate radioattivamente per ibridare direttamente l'mRNA nei tessuti, consentendo la localizzazione dell'espressione genica.
- Differential Display: Tecnica per amplificare e visualizzare tutto l'mRNA presente in un tessuto, utile per identificare geni non noti o differenzialmente espressi.
- Clonazione di Geni: Processo di isolamento e riproduzione di un gene, che include PCR, inserimento in un plasmide (vettore) e studi successivi. I plasmidi contengono generalmente geni per la resistenza agli antibiotici (es. ampicillina) e geni reporter (es. LacZ) per la selezione delle colonie ricombinanti.
- Applicazioni dell'Ingegneria Genetica:
- Produzione di Biofarmaci: Esempi includono l'insulina umana (prodotta in batteri tramite DNA ricombinante) e vaccini ricombinanti (es. vaccino contro l'epatite B in Saccharomyces cerevisiae).
- Terapia Genica: Mira a sostituire geni malati o impedire il loro funzionamento. Gli oligonucleotidi antisenso bloccano l'mRNA e la traduzione proteica, con applicazioni in oncologia, terapia antivirale e ricerca.
- Animali Transgenici e Knock-out: Animali modificati geneticamente per aggiungere o eliminare geni. Sono usati come modelli di patologie umane, per la produzione di farmaci ricombinanti (es. tPA nel latte di topine) e come donatori di tessuti/organi. I modelli Knock-out condizionali permettono l'eliminazione genica in tessuti specifici o in fasi di sviluppo precise.