Appunti VERIFICATO
ESERCITAZIONI LABORATORIO BIOLOGIA MOLECOLARE
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Di cosa parla
- Introduzione alla Mappatura di Restrizione: La migrazione dei frammenti di DNA su gel di agarosio è inversamente proporzionale alla loro massa/lunghezza. L'analisi elettroforetica consente di determinare le dimensioni dei frammenti utilizzando standard noti e di costruire una mappa di restrizione individuando i siti di taglio degli enzimi.
- Materiali Specifici: Agarosio, Tampone TAE, forno a microonde, bagno termostatato a 37°C, enzimi di restrizione (EcoRV, NdeI, HindIII), camera elettroforetica, generatore di corrente, soluzione addensante per il caricamento.
- Preparazione del Gel (1% Agarosio): Si prepara un gel da 30 ml sciogliendo 300 mg di agarosio in 30 ml di tampone TAE. Dopo riscaldamento e raffreddamento a circa 50°C, si aggiungono 3 µl di Bromuro di Etidio (10 mg/ml), un intercalante mutageno per il DNA che richiede precauzioni di sicurezza (guanti e camice). Il gel viene poi versato in vassoietti con pettini per formare i pozzetti di caricamento.
- Digestione con Enzimi di Restrizione: Circa 600 ng di DNA plasmidico vengono digeriti per 30 minuti a 37°C. L'enzima HindIII linearizza il plasmide (5200 coppie di basi). Si preparano quattro campioni di digestione (20 µl ciascuno): EcoRV, NdeI, EcoRV/NdeI (doppia digestione) e HindIII, seguendo le specifiche del produttore per pH e forza ionica, utilizzando 1 unità di enzima.
- Elettroforesi: Ai campioni digeriti si aggiungono un plasmide non digerito (P) e un marcatore di peso molecolare noto (M). Ogni campione riceve 2 µl di “Sample Buffer” (contenente Blu di Bromofenolo, Xilene Cianolo e glicerolo) per facilitare il caricamento e seguire la corsa. I campioni vengono caricati nei pozzetti del gel. L'elettroforesi viene condotta a 100 volt costanti per circa 30 minuti; il DNA, carico negativamente, migra verso l'anodo (polo positivo).
- Esame del Gel: Al termine della corsa, il gel viene osservato su un transilluminatore UV. È fondamentale indossare schermi protettivi e occhiali specifici a causa dei raggi UV nocivi. Si misurano le distanze di migrazione del plasmide linearizzato e dei frammenti del marcatore.
- Analisi e Costruzione della Mappa: Si crea una curva di calibrazione semi-logaritmica tracciando le distanze di migrazione (asse x) rispetto alla lunghezza dei frammenti di riferimento (asse y). Questa curva viene utilizzata per determinare la lunghezza dei frammenti ottenuti dalle digestioni con EcoRV e NdeI, permettendo così di costruire la mappa di restrizione del plasmide ptRc99A-ADH.