Appunti VERIFICATO
LABORATORIO DI VIROLOGIA
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Di cosa parla
- Isolamento in Coltura Cellulare:
- Si basa sull'osservazione di alterazioni morfologiche (effetto citopatico - CPE) causate dal virus nelle cellule.
- Per virus non coltivabili o senza CPE, si rileva la presenza tramite antigeni virali o acidi nucleici.
- CPE include rigonfiamento, arrotondamento e lisi cellulare. Difficile distinguerlo dall'invecchiamento cellulare.
- Metodi di Quantificazione Virale (Titolazione):
- Diluizioni al Punto Finale:
- Preparazione di diluizioni seriali del virus e inoculazione in ospiti sensibili (colture cellulari, uova embrionate, animali).
- Il titolo classico è il reciproco della diluizione più alta che causa un effetto positivo al 100%. Unità: TCID (Colture Cellulari), EID (Uova Embrionate), LD (Animali da Laboratorio).
- Approccio moderno calcola la dose infettiva al 50% (DC50 o TCID50) per maggiore precisione, usando il calcolo della distanza proporzionale.
- Svantaggio: metodo lento.
- Test di Emoagglutinazione (E.A.):
- Metodo rapido che non richiede replicazione virale.
- Alcuni virus (con emoagglutinine) legano i globuli rossi, causando agglutinazione (precipitato a margini frastagliati). In assenza di virus, i globuli rossi si depositano in un bottone compatto.
- Il titolo è il reciproco dell'ultima diluizione che provoca emoagglutinazione (es. 1:64 -> 64 UEA/50 microlitri).
- Conta delle Placche:
- Utilizzato per testare farmaci antivirali. Originariamente per batteriofagi (zone trasparenti di lisi in patina batterica).
- Per virus animali (metodo di Dulbecco): si infettano monostrati cellulari e si copre con terreno semisolido per limitare la diffusione virale.
- L'aggiunta di colorante vitale (es. Rosso Neutro) rende visibili le placche (aree non colorate di cellule lisate).
- Il titolo è espresso in PFU/mL (Unità Formanti Placca/mL).
- Svantaggio: metodo lento.
- Diluizioni al Punto Finale:
- Identificazione di un Virus in Coltura (se non c'è CPE):
- Test di Immunofluorescenza (IF):
- Rileva antigeni virali usando anticorpi specifici marcati.
- Diretta: anticorpo fluorescente si lega direttamente all'antigene.
- Indiretta: anticorpo primario non marcato legato all'antigene, poi anticorpo secondario fluorescente anti-primario.
- Metodo "shell vial" per isolamento rapido: centrifugazione per favorire l'ingresso virale e rilevazione precoce di antigeni.
- Saggi Immunoenzimatici (ELISA) per Antigei Solubili:
- Test ELISA (es. "sandwich"): anticorpo di cattura immobilizzato, aggiunta del campione (antigene), poi anticorpo di rivelazione coniugato con enzima. La reazione enzimatica con substrato produce un cambiamento di colore rilevabile.
- Test di Immunofluorescenza (IF):
- Agglutinazione per Antigei Virali:
- Anticorpi legati a particelle di lattice. Se l'antigene virale è presente, forma un reticolato visibile (deposito granuloso).