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Elettroforesi-
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Di cosa parla
- Definizione e Principio: Migrazione di particelle cariche (ioni o polielettroliti) attraverso un mezzo liquido/solido sotto l'impulso di un campo elettrico.
- Fattori influenzanti: Carica della molecola (q), gradiente di potenziale del campo elettrico (E), resistenza di attrito del mezzo (f). La velocità (v) è proporzionale a E e q, inversamente proporzionale a f. La mobilità (μ) è indipendente dal campo elettrico, ma dipende dalla struttura intrinseca della molecola (carica, dimensioni, forma, PM).
- Tipi di Elettroforesi:
- Elettroforesi in fase libera: Prima metodica (Arne Tiselius, 1937).
- Elettroforesi zonale: Utilizza mezzi solidi, porosi e inerti come carta, acetato di cellulosa, gel di agarosio, gel di poliacrilammide.
- Elettroforesi su Acetato di Cellulosa:
- Usata in analisi cliniche di routine per proteine sieriche, lipoproteine, immunoglobuline.
- Separazione di albumina, α₁, α₂, β e γ globuline. Importante per la diagnosi di condizioni come ipoalbuminemia, bisalbuminemia, mieloma multiplo.
- Elettroforesi Capillare:
- Separazione in fase liquida in microcapillari di silice fusa, rivelazione tramite assorbanza UV.
- Elettroforesi su Gel di Agarosio:
- Polisaccaride per la separazione di proteine e acidi nucleici (DNA/RNA).
- La porosità del gel, controllata dalla concentrazione di agarosio, influenza la migrazione.
- Per il DNA, la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza in basi.
- Etidio Bromuro (EtBr) usato per visualizzare e quantificare il DNA.
- Elettroforesi su Gel di Poliacrilammide (PAGE):
- Polimero molto usato per proteine (PM 5.000-200.000 Da).
- Il monomero di acrilammide polimerizza con bis-acrilammide (cross-linker), persolfato (iniziatore) e TEMED (catalizzatore).
- Vantaggi: resistenza, trasparenza, porosità controllabile, utilizzabile in condizioni native o denaturanti. Svantaggio: monomero neurotossico.
- SDS-PAGE: Condizioni denaturanti (SDS) conferiscono alle proteine una carica negativa netta e uniforme, permettendo la separazione basata sulle dimensioni. Usata in proteomica, controllo omogeneità, determinazione PM, Western blotting. Il sample buffer contiene SDS, β-mercaptoetanolo (agente riducente), glicerolo e blu di bromofenolo.
- Isoelettrofocalizzazione (IEF): Separa le proteine in base al loro punto isoelettrico (pI) in un gradiente di pH stabilito da polielettroliti anfoteri (ampholine). Offre alta risoluzione.
- Elettroforesi Bidimensionale (2D-PAGE): Combina IEF (prima dimensione, separazione per pI) e SDS-PAGE (seconda dimensione, separazione per PM). Permette la risoluzione di migliaia di proteine da miscele complesse, essenziale per la scoperta di biomarcatori tumorali.
- Applicazioni in Biochimica Clinica: Diagnosi di mieloma multiplo, gammopatie policlonali, dislipoproteinemie, emoglobinopatie, analisi isoenzimatiche e degli acidi nucleici.
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