tecniche patologia

La Ricerca di Mutazioni Non Note è cruciale in patologia clinica, e tecniche come la dHPLC (denaturing High Performance Liquid Chromatography) offrono un approccio efficace. Questo processo si basa sull'evidenziazione di alterazioni nelle proprietà fisiche di frammenti genici amplificati tramite PCR.

• Principio della dHPLC: La tecnica sfrutta la formazione di eteroduplex – frammenti di DNA ibridi tra un allele selvatico (Wt) e un allele mutante (Mt) – che presentano proprietà di denaturazione diverse dagli omoduplex (Wt+Wt o Mt+Mt). Questi eteroduplex si formano naturalmente durante la PCR quando si usa DNA genomico di un individuo eterozigote per una mutazione.
• Separazione in base alla denaturazione: La dHPLC separa i frammenti di DNA in condizioni parzialmente denaturanti. La colonna cromatografica viene mantenuta a una temperatura di semi-denaturazione, dove gli eteroduplex mostrano una denaturazione parziale in corrispondenza dei misappaiamenti, mentre gli omoduplex rimangono a doppia elica.
• Meccanismo cromatografico (IP RP HPLC): Utilizza la cromatografia liquida ad alta pressione a fase inversa con accoppiamento ionico (IP RP HPLC). La fase stazionaria è idrofobica (catene alchiliche legate al supporto polimerico), e la fase mobile contiene un solvente organico (acetonitrile, ACN) e un accoppiante ionico (TEAA - trietilammonio acetato). Il TEAA, bifunzionale, si lega al DNA (negativamente carico) e alla fase stazionaria, mediando l'interazione.
• Eluizione differenziale: A causa della denaturazione parziale, gli eteroduplex hanno una minore densità di carica e legano meno TEAA rispetto agli omoduplex. L'eluizione avviene aumentando la concentrazione di ACN: gli eteroduplex, legando meno TEAA, si distaccano prima dalla colonna e vengono eluiti con tempi di ritenzione inferiori rispetto agli omoduplex.
• Rilevazione delle mutazioni: La presenza di una mutazione si evidenzia dalla comparsa di picchi supplementari nel cromatogramma, distinti dai picchi degli omoduplex. La rilevazione avviene misurando l'assorbanza a 260 nm all'uscita della colonna.
• Vantaggi:
  • Completamente automatizzata, rapida (circa 7 min/campione) e meno laboriosa.
  • Costi di gestione contenuti.
  • Elevata sensibilità per mutazioni puntiformi (>97%), adatta per frammenti di 150-300 bp.
  • Riproducibile, utile per applicazioni quantitative e genotipizzazione.
• Svantaggi:
  • La sensibilità è ottimale solo per frammenti di 150-300 bp.
  • Apparecchiatura iniziale costosa.
  • Non identifica la sede o il tipo esatto di mutazione.
  • Bassa discriminazione degli omoduplex e sensibilità ridotta per mutazioni omozigoti/emizigoti.
  • I geni altamente polimorfici possono creare complessità.