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Relazione laboratorio di Genetica
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Di cosa parla
- Scopo: Analisi al microscopio ottico 100x di metafasi umane derivate da colture di linfociti di sangue periferico e ricostruzione del cariotipo post-colorazione con Giemsa.
- Vantaggi dei Linfociti: Facile reperibilità da donatori non infetti e semplicità di coltura in condizioni fisiologiche.
- Composizione del Terreno di Coltura Completo (72 ore):
- RPMI 1640: Terreno specifico per linfociti, ricco di nutrienti. Conservato a 4°C, portato a temperatura ambiente prima dell'uso.
- 10% BSA (Siero Fetale Bovino): Favorisce la proliferazione cellulare, trattato a 56°C per 30 minuti.
- 1.5% Fitoemagglutinina: Stimola la proliferazione linfocitaria (da G0 a G1) e causa l'agglutinazione dei globuli rossi.
- 1% Antibiotici (Streptomicina, Ampicillina): Prevengono la proliferazione batterica.
- Condizioni di Sterilità: Colture allestite in cappa sterile con materiali sterili. La vetreria è sterilizzata a calore secco (160-180°C), la plastica in autoclave (120°C). Alcol e candeggina usati come disinfettanti.
- Preparazione delle Dosi (per 20): 81.5 mL RPMI, 10 mL BSA, 1 mL antibiotici, 1.5 mL fitoemagglutinina.
- Processo di Coltura: Si prelevano 4.7 mL di terreno completo, si aggiungono 300 µL di sangue intero risospeso, si agita e si incuba a 37°C in appositi tubi agitati.
- Blocco della Metafase: Alla 69° ora, si aggiungono 50 µL di Colcemid per bloccare i linfociti in metafase. La coltura viene interrotta dopo 4-6 ore.
- Trattamento Post-Coltura: Centrifuga, rimozione surnatante, risospensione del pellet con soluzione ipotonica (acqua + KCl 0.075 M) per gonfiare le cellule e lisare gli eritrociti.
- Fissazione: Aggiunta di 0.4 mL di prefissativo (5 parti acido acetico, 3 parti metanolo) per fortificare le membrane. La soluzione diventa marroncina per l'ossidazione dell'emoglobina. Dopo centrifugazione, il volume viene portato a 5 mL con metanolo e i tubi conservati a -20°C. Tutte le centrifugazioni sono a 2000 rpm per 5 minuti.
- Preparazione per Colorazione: Due lavaggi in fissativo (2:1 metanolo-acido acetico) per garantire metafasi separate e distinguibili con cromosomi non sovrapposti. I vetrini sono controllati al microscopio a contrasto di fase per verificarne la leggibilità.
- Colorazione Giemsa: Vetrini immersi per 10 minuti (vaschetta coperta con stagnola), poi lavati e asciugati. Per l'analisi, il vetrino coprioggetto viene fissato sul portaoggetto con montante per l'immersione in olio da microscopia.
- Ricostruzione del Cariotipo: Contare i cromosomi, appaiare gli omologhi, ordinarli secondo convenzione.
- Identificazione Cromosomica (senza bandeggio):
- Gruppo A: Identificabili per dimensioni e posizione del centromero (1: metacentrico, bracci p=q; 2: submetacentrico, braccio p
- Gruppi D (18, 19, 20) e G (21, 22): Piccoli acrocentrici. Si contano 6 cromosomi del gruppo D. Nel gruppo G, 4 cromosomi indicano una donna (5 un maschio, per il cromosoma Y).
- Nel vetrino d'esempio, la presenza di 4 cromosomi del gruppo G ha indicato l'origine femminile dei linfociti.
- Gruppo A: Identificabili per dimensioni e posizione del centromero (1: metacentrico, bracci p=q; 2: submetacentrico, braccio p
- Si riescono a contare tutti i 46 cromosomi del cariotipo umano.