Riassunti VERIFICATO
DNA RICOMBINANTE E STRATEGIE DI BASE PER IL CLONAGGIO
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Di cosa parla
- Il DNA ricombinante è formato artificialmente unendo segmenti di DNA provenienti da fonti biologiche diverse, processo reso possibile principalmente dall'impiego di endonucleasi di restrizione di tipo II e DNA ligasi.
- Le endonucleasi di restrizione di tipo II riconoscono sequenze palindromiche specifiche di 4-8 basi e tagliano il DNA in corrispondenza del sito di riconoscimento, generando frammenti con estremità coesive o piatte.
- La DNA ligasi catalizza la formazione di legami fosfoesterici tra i frammenti di DNA, unendo le estremità complementari o modificando le estremità piatte per favorire l'incorporazione in vettori plasmidici.
- I vettori plasmidici utilizzati nel clonaggio molecolare contengono siti multipli di restrizione, geni marcatori di resistenza agli antibiotici e promotori controllabili per la replicazione autonomica e l'espressione del gene inserito.
- Le tecniche di introduzione del DNA nelle cellule ospiti includono la trasformazione batterica tramite cloruro di calcio, l'elettroporazione, la lipofezione per le cellule eucariotiche e l'uso di vettori virali modificati.
- La sintesi di cDNA parte dalla purificazione dell'mRNA mediante affinità con poliU, seguita dalla trascrizione inversa catalizzata dalla trascrittasi inversa e dalla successiva rimozione del filamento RNA tramite ribonucleasi.
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